비타민 c 정량 방법 indophenol 청색

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목차

Ⅰ. 제목
Ⅱ. 목적
Ⅲ. 가설
Ⅳ. 실험방법
Ⅴ. 결과 및 고찰

본문내용

Ⅱ. 목적: 각각의 식품재료의 비타민C측정, 항산화 효과 확인
산화 환원반응에 대하여 이해, 표준비타민 측정방법에 대해 이해, 비타민C 정량법의 원리 이해
Ⅲ. 가설: Indophenol은 산성에서는 적색,알칼리성에서는 청색을 나타내고,환원되면 무색을 나타낸다.
Indophenol 적정법은 Indophenol의 이와같은 성질과 비타민C의 환원성 을 이용하여 비타민C의양을 측정하는빙법이다. 처음에Indophenol 수용액은 청색을 나타내지만, 이 용액에 환원형 비타민C 용액을 떨어뜨리면 그 부분은 잠시 적색을 띠게된다. 계속해서 비타민C용액을 떨어뜨리면 언젠가는 비타민C에 의하여 모든 Indophenol이 환원되어,그 이후에는 비타민C용액을 떨어뜨려도 적색을 띠지 않게 되는데, 이때를 반응종점으로 한다.그러므로 Indophenol수용액에 시료용액을 반응종점까지 떨어뜨린후,두 용액의 소비량을 비교하면 시료 용액의 비타민C함량 측정할 수 있다. 원리: Indophenol은 산성 수용액 중에서 환원형(ascorbic aicd) 에 의하여 환원되어 무색으로 된다.

태그

1. Chapter 1 : Ascorbic acid(환원형 비타민 C)의 정량
2. Chapter 2 : Ascorbicacid(환원형 비타민 C)의 정량
3. Chapter 3 : 비타민 C의 정량
4. Chapter 4 : 비타민 C의 정량
5. Chapter 5 : 비타민 C의 정량
6. Chapter 6 : 총 비타민 C 의 정량
7. Chapter 7 : Dehydroascorbic acid(산화형 비타민 C)의정량

Ascorbic acid(환원형 비타민 C)의 정량

비타민 C는 식품 중에 환원형(ascorbic acid)과 산화형(dehydroascorbic acid)의 두 형으로 존재한다. Ascorbic acid는 환원력이 강하며,산성용액중에서 적색(알칼리성에서는 청색이다)인 색소, 2, 6-dichlorophenol indophenol(이하 indophenol 또는 색소로 약칭함)을 환원시켜 무색으로 한다. 따라서 일정량의 indophenol액을 농도 미지의 ascorbic acid액으로 적정량으로부터 ascorbic acid를 정량할 수가 있다.

이때 역으로 ascorbic acid액에 indophenol액을 적정하여 적색을 나타내는 점을 종말점으로 할 때는 농도와 적정량이 정확히 정비례 관계가 되지 않는다. Indophenol 적정법은 실험조작이 비교적 간단하여 널리 이용되어 왔다. 그러나 척색된 시료의 경우 종말점의 결정이 곤란하며, 또한 ascorbic acid 이외의 환원성 물질이 함유되어 있을 때 이것도 ascorbic acid로 측정되어 참값을 구하기 위해서는 효소법으로 보정하지 않으면 안된다.

비타민 C의 정량

2,6-dichlorophenolindophenol은 ascorbic acid(환원성 비타민C)에 의해서 환원되어 홍색이 무색으로 되므로 indophenol용액에 ascorbic acid를 적하하여 홍색이 없어지는 점을 구하여 정량한 것이다. 즉, dehydroascorbic acid(산화형 비타민 C)를 미리 황화수소에서 환원하여 두면 총 비타민 C를 얻을 수가 있다.

[분석화학실험]Indophenol 적정법의 다양한 방법 레포트

2,6-Dichlorophenolindophenol(이하 indophenol)은 산성 수용액 중에서 ascorbic acid에 의하여 환원되어 무색으로 된다. 따라서 일정량의 indophenol용액에 ascorbic acid용액을 적가하여 용액의 홍색이 사라지는 점��

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Dinitrophenyl hydrazine 비색법 ▶ 원 리
dehydroascorbic acid(산화형 비타민 C)는 dinitrphenyl hydrazine과 작용하여 정량적으로 적색의 Ozazon을 만든다. 따라서 시료 중의 ascorbic acid로 되기 때문에 Ozazon을 만들어서 비색시키면 총 비타민C가 정량 된다.

▶ 시 약
· 0.2% indophenol액 : 2,6-dinitrophenyl indophenol 나트륨 0.2g을 온탕 100 ㎖ 에 용 해 시 킨다. 냉소에 저장하면 2주 유효.
· 5% 및 2% 메탄인산용액
· thiourea메탄인산용액 : 사용시 thiourea 2g을 2%메탄인산 50㎖에 용해하여 물로 100㎖로 한다.
· DNP 용액 : 2,4-dinitrphenyl hydrazine 2g을 9N 황산 100㎖에 용해하여 유리여과기로 여과 한다. 2주간 유효하다.
· 25% 황산용액:물 12㎖에 진한 황산 100㎖를 용해한다. 처음에는 조금씨 천천히 가하고 과열에 주의하면서서로섞는다.
· 8N 황산용액 : 3배의 물에 황산 1배를 천천히 가한다. 과열에 주의한다.
· 비타민 C 표준용액 : 순결정 비타민 C 100㎎을 2%메타인산용액에 용해하여 100㎎로 한다. 이 액 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5㎖를 각각 2% 메타인산용액에 용해하여 100㎖로하여 6종류의 표준용액으로 한다.

▶ 조 작
(1) 시료용액의 조제
indophenol법과 같이한다.
(2) 산 화
3개의 시험과에 시료용액을 2㎖씩 넣고 ①총 비타민 C용 ②dehydroascorbic acid용 ③맹검용으로한다.
①의 시험관에 indophenol용액 한방물을 가열하여 홍색이 될 때 3개의 시험관 각각에 thiurea용액 2㎖를 가한다.
(3) Ozzazon의 생성
① 및 ②의 시험관에 DNP용액을 각각 1㎖씩 가하고 37℃에서 3시간 보온한다. 다음에 3개의 시험과을 빙수중에서 식히며 85%황산용액 5㎖를 주의하면서 조금씩 가하고 흔들어 혼합한 후 ③의 시험관에 DNP용액 1㎖를 가한다. 시험관 전부를 빙수중에서 꺼내어 실온에서 30∼40분 방치한다.
(4) 비 색
시약향에서 만든 6종의 표준용액을 전기의 시험관 ①과 같이 처리하고 비색계의 510∼540mμ에서 비색하여 검량성을 작성한다. 다음에 시험관 ③의 액을 대조용액으로하여 ① 및 ②의 흡광도를 측정한다.

▶ 계산
다음과 같이 시료중의 총 비타민 C, dehydroascorbic acid 및 환원형 비타민 C를 구한다.
총비타민 C량(㎎%) = C1 × (A/2) × (100/S)
dehydroascorbic acid량(㎎%)= C2 × (A/2) × (100/S)
환원형 비타민C량(㎎%) =
총 비타민C량(㎎%) - dehydroascorbic acid량(㎎%)
C1 : 검량선에 의하여 구한 비타민 C량(시험관 ①)
C2 : 검량선에 의하여 구한 비타민 C량(시험관 ②)
A : 조제시료용액량(㎎)
S : 시료 채취량(g)

(식품분석-이론및실습, 조덕제등, 지구문화사)

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2, 4-Dinitrophenyl hydrazine 비색법

▶ 원 리
산화형 비타민 C (Dehydroascrbic acid)는 2, 4-dinitrophenyl hydrazine(이하 DNP로 약칭함)과 작용하여 적색의 osazone을 생성하므로 이의 85% H2SO4 용액의 정색을 비색측정하여 산화형 비타민 C를 정량할 수 있다. 즉, 시료 중의 ascorbic acid를 산화하여 dehydroascr-bic acid로 만들고, 시료 중에 처음부터 함유되어 있는 산화형 비타민 C와 함께 정량하여 총 비타민 C의 양으로 한다. 처음부터 함유되어있는 산화형 비타민 C 만을 별도로 정량하면 양자의 차로부터 ascorbic acid 의 산화에는 앞서 기술한 indophenol이 흔히 사용되며, 반대로 ascorbic acid의 산화방지에는 thiourea 또는 염화제 1주석(SnCl2)이 사용된다. Hydrazine법은 indophenol법보다 정밀도가 높고 비타민C함량이 낮을 경우에도 정확히 측정된다.

본 반응 실제로는 dehydroascrbic acid가 반응조작중에 diketogulonic acid가 되고 이 diketogulonic acid가 DNP와 반응하기 때문에 DNP의 반응은 diketogulonic acid 쪽이 빠르다. 따라서 시료 중에 처음부터 diketogulonic acid가 존재하면 이것도 산화형 비타민 C로서 측정되어 진다. 물론 diketogulonic acid가 비타민 C의 생리효과를 나타내지는 않는다. 산화형 비타민 C를 H2S로 환원시켜 놓으면 diketogulonic acid만이 정량되므로 산화형 비타민 C를 그차로부터 구해도 좋지만, 대부분의 식품, 특히 신선한 식품 중에는 diketogulonic acid의 함량이 극히 적고, 또한 조작도 복잡하므로 조작중의 오차가 크게 생기는 결점이 있다. 따라서 전체를 산화형 비타민 C로 하여 계산해도 별 문제는 없다.

▶ 시약 및기구
① 10% 메타인산용액 : 특급 메타인산(HPO3)으로 10% 용액을 만든다.
② 5% 메타시안용액 : 10% 메타인산용액에 같은 양의 물을 가하여 조제하며, 이것을 냉장고에 보존한다. 약 1주일정도 보존이 가능하다.
③ 2.5% 염화제 1주석-메타인산용액 : 매회 새로 조제한다. 염화제1주석(SnCl2`2H2O)2.5g을 5% 메타인산용액 100㎖ 에 녹인다. 동물성 식품성의 비타민C를 정량할 때 사용된다. SnCl2`2H2O의 결정은 흡수성이 있고 쉽게 산화되므로 주의해야 한다.
④ 1% 염화제 1주석-메타인산용액및 0.5% 염화제 1주석-메타인산용액 : 위와같이 5% 메타인산용액에 녹여서 조제한다
⑤ Thiourea-메타인산용액 : Thiourea[(NH2)2CS]를 5% 메타인산 용액에 2%의 비율로 용해한다.
⑥ DNP용액 : 2, 4-dinitrophenyl hydrazine을 10N H2SO2 용액에 2%의 비율로 용해하여 여과한다.냉암소에 보존하면 1개월간 사용할 수 있다.
⑦ 85% H2SO4 : 진한 H2SO4 (비중 1.84)와 물을 9:1의 용량비율로 혼합한다.
⑧ Indophenol 용액 : 2, 6-법보다 Dichlorophenol Indophenol 의 나트륨염을 0.2%비율로 더운 물에 녹여 여과하여 냉암소에 보존한다.
⑨ 항온수조(water bath) : 37±5℃로 조절하여 사용한다.

▶ 조 작
정량조작은 순서에 따라서 침출, 산화, phenyl hydrazone의 생성, 측정의 4단계로 구분한다.

(1) 침 출
1) 총 비타민 C 정량용 침출액
시료 a g(2~20g, 보통은 10~20g)을 칭취하여 유발에 넣고 소량의 5% 메타인산용액(b ㎖) 및필요에 따라 정제해사 소량을 가하여 잘 마쇄한다. 다음에 {200-(a＋b)}㎖에 상당하는 양만큼 5% 메타인산용액을 가하여 혼합한 후 원심분리하여 고형분을 제거하고 상징액을 침출액으로 사용한다. 이때 침출액의 희석배수 200/a이다. 일반적으로 20배 정도의 희석침출액을 조제하는 것이 좋으며, 이때 첨가한 ascorbic acid의 회수욜 은 98~100%을 나타낸다. 그리고 당류는 침출액중 fructose 0.4%,sucross 0.5%, glucose 0.6%, lactose,galactose, 가용성 전분등 1.0% 이상이면 정량에 영향을 주지만 그이하에서는 별로 영향이 없다. 따라서 감, 시금치, 양배추는 50배, 배추, 바나나, 감자는 30배, 고구마는 15배, 가지, 무, 토마토, 당근, 수박 등은 15배, 오이, 양파는 10배로 희석하는 것이 적당하다.
2) 산화형 비타민 C 정량용 침출액
침출조작중에 ascorbic acid의 산화를 방지하기 위해 산화방지제를 첨가한 메타인산용액을 이용하여 1)과 같이 조작한다. 즉,시료 a g을 취하여 이것에 40㎖ 의 2.5% 염화제 1주석?메타인산용액및정제해사를 가하여 마쇄한 후에 (160-a)㎖의 5%메타인산용액을 가하여 혼합, 침출한다. 이 액을 원심분리하여 상징액을 1)과 같이 침출액으로 사용하며, 희석배수는 200/a이다. 그러나 메타인산만을 사용하여 침출할 때의ascorbic acid의 산화는 겨우 몇 % 정도이며, 강화식품의 경우에는 이 양을 무시할 수 있으므로 총 ascorbic acid 정량용 침출액을 가지고 대응할 수 있다.

(2) 산 화
총 ascorbic acid 정량용 침출액 2㎖씩을 2개의 공전시험관에 취하고, 양 시험관에 Indophenol 액 1방울씩을 적가하여 혼합하고 약 1분간 방치하여도 반응액이 분홍색을 유지할 때까지 적가를 계속한다. 이 경우 첨가할 Indophenol 액은 4방울 이내이어야 한다. 그이상일때는 5% 메타인산용액으로 침출액을 희석하여 사용한다. 다음에 각 시험관에 1% 염화제 1주석-5% 메타인산용액을 각각 2㎖ 씩 가한다. 이때 분홍색은 곧 소실된다. 산화형 ascorbic acid를 정량할 경우에는 이 Indophenol 산화는 필요하지 않으므로 산화형 ascorbic acid 정량용 침출액(b) 2㎖씩을 넣은 2개의 시험관에 0.5% 염화제1주석-5% 메타인산용액을 2㎖ 가한다. 단, 침출액으로서 총 비타민 C용의 것을 대용하는 경우에는 1% 염화제 1주석-5% 메타인산 용액을 가한다.

(3) phenyl hydrazone의 생성
총 비타민 C 정량용 시험관 및산화형 비타민 C 정량용 시험관으로부터 각각 1개씩 취하여 여기에 DNP액을 각각 1㎖ 가한다. 이 시험관을 37℃의 항온수조에서 정확히 3시간 방치하여 반응시킨다.Dehydroascrbic acid와 DNP와의 반응은 37℃에서 3시간으로 85%정도가 진행된다. 100% 반응시키기 위해서는 5~6시간을 요한다. 그러나 이것은 상당히 긴 시간이므로 3시간 정도로 한다. 단 표준 ascorbic acid 용액과 시험용액을 동일조건으로 반응시킨다. 한편 당질이 적은 시료는 50℃에서 30분간 반응시켜도 거의 같은 목적을 달성할 수 있다. 남은 1개의 시험관은 맹시험용으로 하고 여기에는 DNP액을 가하지 않고 37℃에서 3시간 방치한다.

(4) 측 정
반응 후 즉시시험관을 얼음물 속게 넣어 진탕하면서 85% H2SO4 5㎖를 뷰렛으로 서서히 가하여 잘 진탕한다. 이때 급속히 H2SO4 를 주가 하면 반응액의 온도가 상승하고 일부 유기물이 분해되어 착색되며, 맹시험 값이 높아져 오차의 원인이 된다. H2SO4 5㎖ 주가에 2~3분을요한다. 다시 DNP 액을 가하지 않은 맹시험용 시험관쪽에 냉각시키면서 DNP 액 1㎖ 를 가하여 잘 혼합한다. 각 시험관을 얼음물에서 꺼내어 실온에서 30분간 방치한 후 540㎚에서 흡광도를 측정한다. 총 비타민 C 용 시료액의 흡광도를 E, 산화형 비타민 C용 시료액의 흡광도를 E', 맹시험용 시료용액의 흡광도를 E0 , E0'로 한다.

(5) 표준곡선
위의 방법에 의해 구한 총 비타민 C 및산화형 비타민 C에 대한 흡광도는 ascorbic acid 표준액을 사용하여 미리 작성해 놓은 표준곡선과 대조한다. 표준곡선은 직선이 되므로 흡광도에 해당하는 ascorbic acid 의 양을 계수로서 산출해 놓으면 시료의 비타민 C 함량은 간단히 계산으로 구해진다.
[표준곡선의 작성법]
1) Ascorbic acid 표준액의 조제
매회 사용할 때 새로이 조제한다. Ascorbic acid 표준폼 10.0㎎을 정확히 칭량하여 5% 메타인산용액에 녹여 정확히 100㎖로 한다. 이 액의 일부를 5% 메타인산용액으로 10배 희석하여 1㎎ /100㎖의 액을 만든다.
2) Ascorbic acid 표준액 2㎖를 3개의 공전시험관에 취하고 1개는 총 비타민 C측정용 다른 1개는 산화형 비타민 C 측정용, 나머지를 맹시험용으로 하여 사용하고 상기(2)~(4)와 같은 방법으로 조작하여 각각의 hydrazone 정색을 파장 540㎚에서 측정한다. 흡광도를 각각 순서대로 E, E', E0라 한다. 여기서 E 및 E0 로부터 흡광도 1에 대한 ascorbic acid 의 양을 시료액의 농도 단위로 표시한 계수는 다음과 같다.
F＝ C/ E－E0
단, C는 ascorbic acid 표준액의 농도로 이 경우 1㎎ /100㎖이다. 같은 방법으로 0.5㎎ /100㎖ 및기타 몇 개의 농도가 다른 ascorbic acid에 대하여 F 값을 구하고, 그들의 F 값이 일치하면 이 F 값을 이후 계산에 사용한다.

▶ 방법도시

그림 8-13 DNP법에 의한 비타민 C의 정량

▶ 계 산
피시료액에 대해서 구한 흡광도가 총 비타민 C 에 대해서 E, 산화형 비타민 C에 대해서 E', 맹시험에 대해서E0 , E0'라고 한다면, 비타민 C의 양은 다음식에 의해 계산한다.
총 비타민 C(㎎ /100㎖) ＝F× (E－E0)
산화형비타민 C(㎎ /100㎖) ＝F× (E'－E0')
환원형비타민 C＝(총 비타민 C) －(산화형 비타민 C)
식품으로 침출액을 조제하였을 때의 희석배수를 D 라고하면, 식품중의 총 비타민 C 및산화형 비타민 C의 양은 다음과 같이 된다.
총 비타민 C(㎎ /100㎖) ＝D × F× (E－E0)
산화형비타민 C(㎎ /100㎖) ＝D ×F× (E'－E0')
Hydrazine 법에서는 위의 조작에 따라 얻어진 사료액이 다량의 ?류를 함유하고 있는 경우에는, DNP 가 당류와도 반응하여 그것의 hyd-razon을 생성하여 흡광도가 높게 될 때가 있다. 이 점이 hydrazine 법의 결점이지만 다음과 같은 보정법이 제안되어 있다. 즉,dehydroa-scorbic acid는 0℃에서는 전혀 DNP 와 반응하지 않는데 반하여 당류는 0℃에 있어서도 약간 반응한다. 당과 DNP 에 의한 흡광도 E－E0를 위의 정량조건의 37℃에서 3 시간의 경우와 0℃에서 3시간의 경우에 대해서 비교하여, 다음의 관계가 성립된다.
(E－E0)37℃
――――――――― ≒ 1.6 ± 0.1
(E－E0)0℃
이 관계를 이용하여 시료를 0℃에서 3시간 반응시켜 얻어진 (E－E0)에 1.6을 곱한 값을 보통과 같이 37℃에서 3시간 반응시켜서 얻은(E－ E0)에서 빼면 비타민 C만에 의한 흡광도가 얻어진다.

(표준식품분석학, 채수규등, 지구문화사)

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Vitamin C 정량법 【1】vitamin C
식품 중의 vitamin C 에는 환원형인 L-ascorbic와 산화형 dehydro ascorbic acid의 두 종류가 있다. ascorbic acid는 환원력이 세고 산성용액 중에서 홍색색소인 2,6-dirchloro phenolindophenol을 환원해서 무색으로 변환시킨다.

그림 10-13   vitamin C의 환원형과 산화형

이 성질을 이용하여 농도를 알지 못하는 ascorbic acid액에 indophenol을 적정해서 ascorbic acid를 정량할 수 있다. 또 산화형인 dehydro ascorbic acid는 HS로써 환원시키면 완전히 ascorbic acid로 변하므로 위와 같이 정량할 수가 있다. 이렇게 indophenol로 적정하여 vitamin C를 정량하는 일을 indophenol 용량법이라 한다.

그림 10-14   indophenol의 반응

indophenol 용량법은 간편한 방법이기는 하나 식품 중에 ascorbic acid 이외의 환원생물질에 대해서도 동일하게 반응하며, 또 색깔이 있는 식품은 적정의 종점을 결정하기가 어렵다는 등 여러 가지 결점이 있다.
여기서는 현재 가장 널리 이용되고 있는 hydrazine 비색법을 설명하기로 한다.

【2】hydrazine 비색법

▶ 원 리
이 방법은 매우 매량의 vitamin C도 정확하게 정량할 수 있다는 것이 장점이다. 산화형인 dehydroascorbic acid는 2,4-dinitrophenyl hydrazine(DNP로 약함)을 만나면 붉은색의 osazone을 만든다. 이것을 c-HSO에 녹여서 vitamin C의 비색정량에 이용한다. 곧 시료 중의 ascorbic acid를 산화해서 dehydroascorbic로 변환시키고, 시료 중에 있던 dehydroascorbic acid와 함께 정량하여 총 vitamin C 양을 구한다. 한편 시료 중에 처음부터 산화형으로 존재하던 dehydro ascorbic acid만을 정량하여 총 vitamin C 함량으로부터 뺀 값이 환원형 vitamin C 곧 ascorbic acid의 함량이다.

그림 10-15   ascorbic의 변화

▶ 기구·장치
① water bath : 37°C±0.5°C로 조절할 수 있는 수조.
② 원심분리기 : 3000rpm 정도의 원심분리기.
③ 광전비색계 : spectronic 20.

▶ 시약조제
① 10% 메타인산용액 : 특급 막대 모양의 meta-phosphoric acid(HPO3) 100g을 물에 녹여서 1ℓ로 한다.
② 5% 메타인산용액 : 10% meta-phosphoric acid 용액 일정량에 같은 부피의 물을 더하여 만든다. 냉장고에 보관하되 1주의 이내에 사용해야 한다.
③ 2.5%염화제일주석·메타인산용액 : 사용할 때마다 새로 만들어 쓴다. stannous chloride(SnCI2·2H2O2) 2.5g을 5% HPO3 100㎖에 용해시킨다.

④ 1% SnCI2·HPO3용액 및 0.5% SnCI2·HPO3 용액 : 2.5% 용액과 같이 5% HPO3에 녹여서 만든다.
⑤ 2% 티오우레아·메타인산용액 : thio urea(NH2CSNH2) 2g을 5% HPO3에 녹여서 100㎖로 한다.
⑥ 2% DNA용액 : 2,4-dinitrophenylhydrazine(DNP) 2g을 10N H2SO4에 녹여서 100㎖되도록 하고 침전이 생기면 glass filter로 여과해서 쓴다. 차고 어두운 곳에 보관하면 2주간은 사용할 수 있다.
⑦ 85% 황산 : c-sulfuric acid (c-H2SO4, SpGr = 1.84) 9부피를 물 1부피에 조금씩 서서히 가해서 녹인다.
⑧ 0.2% 인도폐놀용액 ; 0.2g의 2,6-dichlorophenolindophenol-Na salt를 따뜻한 물에 녹여서 100㎖로 한다. 여과해서 쓴다.
⑨ vitamin C 표준용액 : L-ascorbic acid의 결정 약 4㎎을 정확하게 칭취하여 100㎖ meas flask에 받아서 2% HPO3를 조금 가하여 완전히 녹인 다음 다시 2% HPO3를 더하여 표선까지 채운다. 냉장고에 보관한다.

▶ L-ascorbic acid의 농도규정
① 0.001N 요오드산칼륨용액조제 : 특급 potassium iodate(KIO) 0.357g을 정확히 칭취해서 100㎖들이 meas flask에 받아 물을 가하여 녹고 다시 물을 더하여 표선까지 채운다. 이 용액은 0.1N KIO이다. 갈색병에 담아 냉장고에 보관하고 필요할 때 그 1㎖를 pipette으로 뽑아서 물을 더하여 100㎖로 희석하면 0.001N KIO 용액이 된다.
② 농도규정(적정) : ascorbic acid용액 5㎖를 50㎖ 삼각flask에 받아서 0.5㎖의 6% KI용액(KI 1.2g을 물 20㎖에 녹여 만든다. 갈색병에 보관한다)과 전분용액(가용성 전분 0.1g을 10㎖의 더운 물에 녹이고 다시 NaCI 3g을 가하여 녹인 것)을 3~4방울 가하여 혼합한다. microburttr으로써 0.001N KIO3용액으로 적정한다. 삼각 flask 밑에 흰종이를 깔고 한 방울씩 떨어뜨려서 잘 섞고 전분이 요오드를 만나 청색으로 변하는 점을 종점으로 한다.
맹시용으로 ascorbic acid 대신 2% HPO3 5㎖를 삼각 flask에 받아서 위와 동일하게 처리하고 적정치를 구하여 ascorbic acid의 적정치로부터 감한다.
③ 계산 : 0.001N KIO3 1㎖는 다음 반응식에 따라 ascorbic acid 0.088㎎에 해당한다.
KIO3 + 5KI + 6HPO3 → 6KPO3 + 3H2O + 3I3
3C6H8O6 + 3I2 → 3C6H8O6 + 6HI
ascorbic acid
(M. W. 528.39)
산화제 KIO3는 6원자의 I를 산화하였으므로 그 1mole은 6g당량이다. 따라서 0.001N KIO 1㎖에 상당한 ascorbic acid량은
528.39g × 0.001 × (1/1000) × (1/6)= 0.088㎎
∴ 0.001N KIO 1㎖ = 0.088㎎ ascorbic acid
따라서 ascorbic acid용액 5㎖에 0.001N KIO(역가 f)를 적정하는데 A㎖가 소요되었다면 ascorbic acid 농도는 f × (A/5) × 0.088㎎/㎖ 이다.

[예제]
         특급 KIO 0.3658g을 물에 녹여 0.1N KIO를 만들고 이것을 희석한 0.001N KIO          용액으로 ascorbic acid용액 5㎖를 산화시키는 데에 2.080㎖가 소요되었다.          ascorbic acid 1㎖ 속의 함량은 ?
이 때 맹시 측정치는 0.140㎖이다.
[해] (0.3658/0.357) × {(2.080-0.140)/5} × 0.088 = 0.035㎎/㎖

▶ 정량법
정량은 추출, 산화, 측정의 차례로 진행한다.

[추출]
① 순 vitamin C 정량용 추출액 : 시료 10~20g(ag)을 칭취하여 mortar에 담고, 5% HPO3를 조금(b㎖) 가하고 sea sand를 다하여 마쇄한다.

② 산화형 vitamin C 정량용 추출액 : 시료 10~20g(a g)에 40㎖의 2.5% SnCI2·HPO3와 정제 sea sand를 가하여 마쇄하고 5% HPO3 (160 - a)㎖를 더하여 잘 혼합하고 원심분리해서 공시한다. 희석배수는 200/a 이다.

 [산화]
① 시험관 A, B, C 3개를 준비하고 시험관 A(총 vitamin C용) 에는 총 vitamin C 추출액 2㎖, B(산홯형 vitamin C용) 및 C(맹시용)에는 산화형 vitamin C 추출액을 각각 2㎖씩 가한다.
② A에만 0.2% indophenol 용액을 1방울 떨어뜨려서 1분간 흔들어 pink색이 사라지면 다시 1방울을 가하고 색이 퇴색되지 않을 때까지 1방울씩 가한다.
③ A, B, C 에 각각 0.5% SnCI2·5% HPO3 2㎖씩 가한다.
④ A 및 B에 2% DPN 용액 1㎖씩을 가하고 A, B, C 모두 37°C±0.5°C의 water bath에서 정확히 3시간 가온한다.
⑤ A, B, C를 얼음 속에 냉각하면서 85% H2SO4 5㎖를 pipette으로 뽑아서 한 방울씩 서서히 가한다.
⑥ C에만 2% DPN 1㎖를 가하여 혼합한다.
⑦ A, B, C를 모두 실온에서30분간 방치한 후 측정한다.

 [측정]
반응액을 cuvete에 담아서 광전비색계 540nm에서의 흡광도를 측정하고 표준용액으로 만든 검량선에 따라 그 농도를 구한다.
[검량선(calibration curve)]
① 앞에서 만든 VC표준용액(1㎖= 40㎍) 5㎖를 pipette으로 뽑아서 2% HPO3로 100㎖되도록 하면 1㎖ = 2㎍ 용액을 얻는다.
② 시험관 5개에 각각 0㎖(맹시용), 0.5㎖(1㎍), 1㎖(2㎍), 2㎖(4㎍), 5㎖(10㎍)씩 분취하여 총 VC정량할 때와 같이 처리하여 비색하고 그래프 용지의 X축에 농도, Y축에 흡광도를 정하여 plot하고 검량선을 만든다.

표 10-1   VC표준용액의 흡광도(1㎖ = 2㎍ VC)

그림 10-16   VC검량선

 ▶ 결과정리
VC (㎎%) = n × 10-3 × (V/2㎖) × (100/S)
n : 흡광도와 검량선으로 구한 VC양(㎍)
10-3 : ㎍→㎎ 단위환산
V : 추출액전양(㎖)
S : 시료채취량(g)
ascorbic acid(mg%) = 총 Vitamin C (㎎%) - 산화형 Vitamin C (㎎%)

 [Procedure]
1. L-ascorbic acid의 농도규정
ascorbic acid 표준용액 5㎖ +6% KI 0.5㎖ 첨가 → 전분용액 3방울 첨가 → 0.001N KIO3로 적정 → 계산
맹시 ascorbic acid 용액 대신 2% HPO2 5㎖를 위와 같이 처리
2 추출
총 VC용 : 시료 10~20g(a g) + 5% HPO3 (b ㎖) + sea sand → 5% HPO3 [200 - (a + b)]㎖ 첨가 → 원심분리 → 추출액
산화형 VC용 : 시료 10~20g(ag) + 2.5% SnCI·HPO 40㎖ + sea sand → 마쇄 → 5% HPO(160 - a) ㎖ 첨가 → 원심분리 → 추출액
0.2% indophenol  0.5% SnCI, 5%  HPO  2%DPN
A : 총 VC추출액 2㎖ →    +1방울, 1방울     →    2㎖    →    1㎖     ┐
시험관 B : 산화형VC추출액 2㎖        →     →    2㎖    →    1㎖                   → → → →
C : 산화형VC추출액 2㎖(맹시) →    →    2㎖    →    ―                   ┘            ↓
← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ← ←
→ 37±5°C에서 3시간 가온 → 얼음 속에서 냉각 → 85% HSO 5㎖를 A, B, C에 각각 첨가 → C에만 2% DPN 1㎖ 첨가 → 30분간 방치 → 측정 → 계산
[예제]
         제주도산 귤의 ascorbic acid 정량 결과는 아래와 같다. 그 함량을 계산하라.
시료                온주 밀감(제주도산)
시료채취량(S)       1.5754g
추출액전량(V)       200㎖
흡광도 ┌ 총 VC         0.315 ┐ → 검량선 ┌ 9.5㎍
└ 산화형        0.045 ┘               └ 1.4㎍
[해]       총 VC (㎎%) = 9.5 × 10-3 × (200/2) × (100/1.5754) = 60.3
dehydroascorbic acid (㎎ %) = 1.4 × 10-3 × (200/2) × (100/1.5754) = 8.9
∴ascorbic acid (㎎ %) = 60.3 - 8.9 = 51.4

(식품분석, 이만정)