Agarose gel electrophoresis 실험 방법

Agarose는 agar (한천)에서 정제한 물질로 agarobiose라는 6탄당의 polymer입니다. Agar는 agarose와 agaropectin으로 구성되는데, agar는 주로 미생물의 배지에 사용하고 agarose는 전기영동에 이용됩니다. 고형 agarose는 물에 잘 녹지 않지만 온도를 올리게 되면 분자간의 수소결합이 끊어져 녹게되고 다시 온도를 낮추면 고형이 되는 성질을 가지고 있습니다.

이는 한천묵이나 도토리묵이나 만드는 방법이 같은 것은 이러한 수소이온결합을 이용하기 때문입니다.

Polymer가 수소결합에 의해 형성되는 과정에서 분자간에 미세한 통로가 생기는데, 농도가 높을 수록 통로는 좁아지고 낮은 수록 통로는 넓어집니다. 마침 그 통로의 크기가 DNA의 크기식별을 위한 크기와 맞아 떨어짐은 물론 탁도가 낮아 예전부터 agarose를 많이 사용해 온 것입니다. 한천묵을 만들때 물을 너무 많이 넣고 끓이면 묵이 묽어지는 것과 같은 원리입니다.

Agarose를 DNA전기영동에 이용할 수도 있으나 같은 %에 비해 탁도가 높기 때문에 DNA가 잘 안보이며 자체로서 이온화된 물질들을 포함하고 있어 (가령 sulfer화합물) 전기장에서 DNA의 이동을 방해합니다. 이때문에 다소 고가라도 agarose를 사용하고 있는 것입니다.

개발하고자 하는 의지가 있고 또한 DNA는 반드시 agarose를 이용해야 한단 선입견만 버린다면 얼마던지 같은 원리의 다른 값싼 물질을 찾는 것은 그리 어렵지 않을 겁니다.

Agarose gel 전기영동

Ⅰ. 전기영동의 원리

전기영동(electrophoresis)은 전기장의 영향을 받아 하전된 물질들이 유동성 매체 내에서 이동하는 것을 말한다. 전하 또는 크기가 다른 분자들은 서로 다른 속도로 이동하며 이것이 전기영동 분리의 기본이 된다. 아가로즈(agarose)는 갈락토스(galactose)와 겔리듐 아만시(Gelidium amansii)의 한천(agar)으로부터 유도된 3,6-안하이드로칼락토스 단위체들 (anhydrogalactose units)로 구성되는 천연의 다당류이다. 겔은 전분 겔과 유사한 방법으로 끓는 물에 건조한 중합체를 넣고 상온에서 식힘으로써 얻어진다. 전분 겔보다 다공성 구조이며 적절한 강도를 가진다. 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은 보다 진정한 의미의 전기영동으로써 하전 된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스 효소 복합체, 지질단 백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.

Ⅱ. 실험재료

Agarose gel(agarose, 0.5X TBE), DNA추출용액, 6X Gel loading buffer, Safe shineGreen Stain(EtBr-대체염색약), Staining Box, 전기영동장치, 전원공급장치, 0.5X TBE, (yellow) tip, 마이크로피펫, e-tube(1.5ml)

전기영동을 할 때 Gel 이 잠기는 buffer solution에는 여러 가지가 있으나 주로 TAB와 TBE가 사용된다.

TAE는 주로 Agarose gel electrophoresis에 사용되고, TBE는 DNA sequencingdp 주로 사용된다.

그러나 큰 차이가 나는 것은 아니므로 교차로 사용되기도 한다.

Ⅲ. 실험과정

1. Agarose gel 만들기

① Agarose 0.24g, 0.5X TBE buffer 30ml를 삼각플라스크에 넣는다. (0.8% Agarose gel) (5X TBE buffer 1L : Tris base 54g, Boric acid 27.5g, 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml, 증류수)

② 전자렌지에 1～2분 정도 또는 알코올 램프로 가열하여 끓여 녹인다.

③ 젤 용액을 식힌 후 젤 제작 키트에 붓는다.

④ 젤이 굳은 후 전기영동에 사용한다.

Pre-made Agarose gel(1%, 0.5X TAE or TBE): 바로 DNA 전기영동을 할 수 있도록 미리 만들어 놓은 아가로스 겔로서 실험시간을 대폭 줄일 수 있습니다.

2. 전기영동하기

① 전기영동 장치에 gel을 올려놓은 후에 0.5X TBE 용액을 부어 gel이 살짝 잠기게 한다.

② 준비된 DNA 용액 15㎕에 Gel loading buffer을 3㎕씩 넣고 섞어준다.

Gel loading buffer: 색깔을 나타내는 성분 외에도 glycerol 이 들어있어 DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈(well)으로 잘 가라앉히는 역할을 한다. 색깔을 나타내는 성분은 DNA와 같이 전기영동 되어 DNA의 흘러간 정도를 알 수 있게 한다.